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鎳-瓊脂糖凝膠FF（Ni-Berpharose FF）

1.      產(chǎn)品介紹

鎳-瓊脂糖凝膠FF以瓊脂糖微球為基質，活化偶聯(lián)亞氨基二乙酸（IDA），之后螯合Ni2+。IDA是金屬螯合層析中常用的配體，和次氮基三乙酸（NTA）相比，IDA具有親和力強、載量高、可再生重復使用等優(yōu)點。

鎳-瓊脂糖凝膠FF主要用于純化含有組胺酸標簽（His-Tag）的重組蛋白。組胺酸標簽中的咪唑環(huán)同過渡金屬Ni2+形成穩(wěn)定的配位鍵，能特異、牢固和可逆地吸附在固定有Ni2+的基質上，可通過增加咪唑濃度對重組蛋白進行競爭洗脫。

2.規(guī)格

1ml（預裝柱）、5ml（預裝柱）、10ml（預裝柱）、20ml、100ml、500ml

4.純化流程

①平衡

鎳-瓊脂糖凝膠FF柱用2~5個柱體積的初始緩沖溶液進行平衡。

建議流速為100 cm/h。

②上樣

（1）樣品一般溶解于pH6~8的初始緩沖液中。提高上樣緩沖液的pH值可以增大載量。

（2）緩沖液中不能含有EDTA和檸檬酸鹽，同時避免巰基乙醇、DTT等還原劑。

（3）常用緩沖液有10~100 mM鈉緩沖液、20~200 mM Tris-HCl緩沖液等。

（4）緩沖液中一般要加入0.15~0.5 M的NaCl以消除離子交換作用。

（5）初次使用鎳-瓊脂糖凝膠FF時，推薦使用50 mM PBS（50 mM NaH2PO4，0.5 M NaCl,pH 7.4）作為初始緩沖液。

③洗脫

（1）增加咪唑濃度進行洗脫是鎳-瓊脂糖凝膠FF常用的洗脫方法。

（2）咪唑為堿性，相應緩沖液配制后需要用HCl調節(jié)pH值。

（3）初次使用鎳-瓊脂糖凝膠FF時，如不確定洗脫需要的咪唑濃度，推薦在初始緩沖液中分別加入10 mM、20 mM、50 mM、100 mM、200 mM、500 mM咪唑，濃度從低

到高分別洗脫和收集重組蛋白，之后通過SDS-PAGE電泳等方法鑒定洗脫結果。

（4）有條件的可以進行咪唑梯度線性洗脫以確定較佳的洗脫條件。

洗脫方法

（1）降低pH洗脫：大多數(shù)蛋白在pH6~4會被洗脫下來（也可以在pH 3~4），緩沖液可以是醋酸鈉、檸檬酸和鹽緩沖體系。

（2）競爭性洗脫：線性增加或一步增加同金屬離子有親和力的競爭物質的濃度（如0~0.5M咪唑、0~50 mM組胺酸、0~2M NH4Cl）。梯度洗脫在起始緩沖液的恒定pH值下進行。

（3）螯合劑洗脫：EDTA、EGTA等螯合劑可同金屬離子產(chǎn)生作用力，導致蛋白被洗脫下來。此法不能分離不同的蛋白，還會影響蛋白的吸附，導致融合蛋白無法掛柱。

注：降低pH洗脫和螯合劑洗脫會使得金屬離子脫落，下次使用前需要重新螯和金屬離子。常用的方法為競爭性洗脫。

上述洗脫方法，均須在緩沖液中加入150 ~500mM的NaCl以消除離子交換作用。

5.再生、清洗、保存

①凝膠再生

（1）多次使用后或需要更換螯合的金屬離子時，必須將凝膠脫鎳再生。脫鎳方法：用5~10個柱體積的蒸餾水淋洗柱子，再用5~10個柱體積的100 mM EDTA淋洗柱子，用2~3個柱體積的0.5 M NaCl洗掉殘留的EDTA。

（2）多次使用的柱子脫鎳后一般需要進行清洗。清洗方法：用0.1~1.0 M NaOH反向清洗柱子，50 cm/h保持1~2 h，能去除結合強的雜質，同時也能去除熱源。

（3）清洗后需要重新螯合金屬離子。螯合方法：用2~5個柱體積的蒸餾水充分平衡脫鎳后的柱子，用0.1~0.3 M金屬鹽溶液過柱5~10個柱體積以螯合金屬離子，之后用5~10個柱體積的蒸餾水淋洗以去除未螯合的金屬離子。

②在位清洗

（1）去除因離子交換作用吸附的蛋白：2~3個柱體積的2 M NaCl溶液反向清洗。

（2）去除強疏水性蛋白和脂質等：4個柱體積的70%乙醇或者30%異丙醇反向清洗。

（3）除去蛋白沉淀、疏水性蛋白：參照凝膠再生步驟。

6.注意事項：

1)使用時柱子和緩沖液的溫度一致，避免柱床內(nèi)產(chǎn)生氣泡，影響純化效果。

2)本產(chǎn)品保存條件為20%乙醇，4~8℃。

3) 2-25℃,常壓,避光運輸