1.確定抗生素作用的濃度：不同的細(xì)胞株對各種抗生素有不同的敏感性，因此在篩選前要做預(yù)試驗，確定抗生素對所選擇細(xì)胞的zui低作用濃度。
① 提前24 小時在96 孔板或24 孔板中接種細(xì)胞8 孔，接種量以第二天長成25%單層為宜，置CO2 孵箱中37℃培養(yǎng)過夜。
② 將培養(yǎng)液換成含抗生素的培養(yǎng)基， 抗生素濃度按梯度遞增0,(50, 100, 200, 400, 600, 800 和1000μ g/ml)。
③ 培養(yǎng) 10-14 天以絕大部分細(xì)胞死亡濃度為準(zhǔn),一般為 400-800μg/ml，篩選穩(wěn) 定表達(dá)克隆時可比該濃度適當(dāng)提高一個級別維持時使用篩選濃度的一半。
2.轉(zhuǎn)染按前面的步驟進行。
3.轉(zhuǎn)染 72 小時后按 1: 10 的比例將轉(zhuǎn)染細(xì)胞在 6 孔板中傳代，換為含預(yù)試驗中 確定的抗生素濃度的選擇培養(yǎng)基。在6 孔板內(nèi)可見單個細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)可見單個 細(xì)胞分裂繁殖形成單個抗性集落，此時可用兩種方法挑選單克隆。
① 濾紙片法：用消毒的5x5mm 濾紙片浸過胰酶，將濾紙片貼在單細(xì)胞集落上10-15 秒，取出粘附有細(xì)胞的濾紙片放于 24 孔板中繼續(xù)加壓培養(yǎng)。 細(xì)胞在 24 孔板中長滿后轉(zhuǎn)入25cm2 培養(yǎng)瓶中，長滿后再轉(zhuǎn)入 75cm2 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
② 有限稀釋法：將細(xì)胞消化下來后做連續(xù)的 10 倍稀釋(10-2-10-10) ，將每 一稀釋度的細(xì)胞滴加到 96 孔板中培養(yǎng)，7- 10 天后，選擇單個克隆生長的孔再一次進行克隆。
4. ELISA或 Westernblot檢測單克隆細(xì)胞中外源蛋白的表達(dá)情況由于不同克隆的 表達(dá)水平存在差異因此可同時挑選多個克隆選擇表達(dá)量zui高的克隆傳代并保種。
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